ilahnurlaelah.edublogs.org/

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

PROGRAM S2 BIOLOGI FAKULTAS BIOLOGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

2009/2010

ILAH NURLAELAH (P2BA09001)

ACARA I.  ISOLASI DNA PLASMID

TUJUAN :

Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19
2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair
3. Ampisilin
4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)
5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
6. Tabung mikrosentrifuga
7. Sarung tangan
8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
9. Lemari pendingin
10. Kamera Digital

CARA KERJA

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).

1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37^oC selama 16 jam (semalam).
2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.
5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali.
6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.
7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal.
8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit.
9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit.
10. 10.  Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga.
11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.
12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.
13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci.
14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama).
15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Komponen penting dalam eksperimen kloning gen adalah vektor yang membawa gen masuk sel inang dan bertanggung jawab atas replikasinya. Untuk dapat bertindak sebagai vektor suatu molekul DNA harus mampu memasuki sel inang serta mengadakan replikasi untuk menghasilkan kopi dalam jumlah yang besar. Salah satu vektor penting yang sering digunakan dalam kloning gen adalah plasmid. Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim. Ukuran plasmid berkisar antara 1 kb untuk yang terkecil dan lebih dari 250 kb untuk yang besar. Ukuran kurang dari 10 kb adalah yang terbaik untuk vektor kloning. Jumlah kopi menunjukkan jumlah molekul plasmid masing- masing yang biasanya ditemukan dalam satu sel bakteri, biasanya berkisar antara 1 sampai 50 atau lebih. Vektor kloning perlu ada dalam sel dengan banyak kopi sehingga dapat dihasilkan molekul DNA rekombinan dalam jumlah besar.

Plasmid pUC19 adalah satu dari tujuh buah plasmid yang diketahui berada dalam sel Eschericia coli. Bakteri inang pembawa pUC19 ini ditumbuhkan dalam medium kompleks: Luria Bertani (LB) sebagai sumber DNA.  Dalam medium LB pada suhu 37⁰ C dengan pengocokan pada kecepatan 150-250 r/menit, sel E. coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai densitas maksimum kira-kira 2-3 x 10⁹ sel/ml.

E. coli JM109 dipanen, diambil 3 ml dan disentrifuse pada kecepatan 5700 x g selama 5 menit. Tujuan dari sentrifugasi ini adalah untuk mengendapkan bakteri pada dasar tabung karena untuk penyiapan ekstrak sel bakteri harus diperoleh dalam volume yang sekecil mungkin.

Setelah didapatkan ekstrak sel, langkah pertama dalam proses isolasi DNA adalah perusakan dan atau pembuangan dinding sel bakteri inang dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Pada praktikum acara ini, perusakan dinding sel dilakukan dengan pemberian STE  sebanyak 1 ml kedalam pelet sel hasil sentrifugasi pertama.

Pemurnian atau isolasi DNA plasmid menggunakan kit QIAprep ini menggunakan metode pemurnian berdasarkan konformasi DNA (dengan denaturasi alkali). Kebanyakan DNA plasmid berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilitan (supercoiled) atau disebut covalently closed circular (CCC) DNA. DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya. Molekul supercoiled ini jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom dan dapat dipisahkan dengan dua cara yaitu: denaturasi dengan alkali, dan pemurnian berdasarkan kerapatan apung (bouyant density) atau dikenal dengan istilah equilibrium density gradient centrifugation atau sentrifugasi isopiknik.

Langkah berikutnya dalam isolasi DNA adalah lisis sel, dimana pada acara ini digunakan buffer P1 dan P2. Buffer P1 sebelumnya telah ditambah dengan enzim RNAse A dan deterjen Sodium Dodesil Sulfat (SDS) dan indikator LyseBlue. RNAse dan SDS adalah kombinasi untuk tujuan perusakan dinding dan lisis sel. Pada pH 12 -12,5 ikatan hidrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah. Untuk mengecek apakah denaturasi ini telah berhasil dengan baik atau tidak, maka penambahan P2 akan memperjelas proses ini. Apabila denaturasi telah terjadi, maka suspensi pelet sel akan berwana biru karena adanya reaksi dengan indikator LyseBlue.

Proses re-naturasi selanjutnya dilakukan dengan cara mengembalikan DNA pada kondisi asam yaitu dengan penambahan buffer N3  yang mengandung asam asetat. Pemberian asam akan menyebabkan DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi, mengelompok dalam massa DNA linier yang kusut. Sentrifugasi selanjutnya pada kecepatan 13000 selama 10 menit akan mengendapkan massa DNA ini di dasar tabung sentrifugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatan.

Penambahan RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris sel lainnya). Presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk menghilangkan sisa protein, tidak perlu dilakukan jika kita menggunakan metode denaturasi alkali.

Supernatan berisi plasmid murni kemudian dicuci dua kali menggunakan buffer PB isinya mengandung isopropanol dan buffer PE yang mengandung 96 – 100% ethanol. Dari Qiaprep spin column, supernatan plasmid kemudian dipindahkan ke tabung mikrosentrifuse baru dan di elusi dua kali dengan buffer EB (Elution Buffer) dimana masing- masing melewati sentrifugasi pada 13000 rpm selama satu menit. Hasil elusi inilah DNA plasmid pUC19  yang telah berhasil kita isolasi dari E.coli JM109.

ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID

TUJUAN :

Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. Plasmid pUC19
2. Enzim restriski (PstI)
3. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
4. Tabung mikrosentrifuga
5. Sarung tangan
6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
7. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)
8. termometer
9. Lemari pendingin (Frezer)
10. Kamera Digital

CARA KERJA

1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom, yaitu enzim PstI.
2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI
3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl.
4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.
5. tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).
6. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 ⁰C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.
7. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.

Beberapa syarat suatu plasmid dapat digunakan sebagai vektor kloning adalah: mempunyai sekurang- kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang, dan mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA.

Plasmid pUC19 memiliki jumlah kopi yang tinggi dan ukuran panjang 2686 bp. pUC19 memiliki komposisi seperti plasmid buatan pBR322 dan M13mp19. Plasmid pUC19 mengandung origin of replication (ORI) yang berupa pMB1 replikon rep, gen bla yang membuat resisten ampicilin, operon lac mengandung CAP situs pengikatan protein, promoter Plac, lac repressor situs pengikatan, dan 5’ bagian terminal  gen lacZ yang mengkode  fragmen N-terminal beta galactosidase. Plasmid ini memiliki multiple cloning site (MCS) pada frame gen lacZα, dimana beberapa enzim restriksi dapat diaplikasikan pada satu situs pemotongan (pada urutan basa yang sama). Misalnya Apo I dan EcoRI yang sama –sama memotong plasmid pada basa ke 396.

Endonuklease adalah enzim yang memecah ikatan fosfodiester internal pada molekul DNA. Salah satu endonuklease yang penting adalah endonuklease restriksi tipe II, yang memiliki sifat-sifat antara lain: mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA, memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa. Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen- fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing- masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif.

Tiga enzim restriksi tipe II yang digunakan dalam praktikum ini adalah HindIII,  Pst l, dan EcoRI. Semua enzim restriksi produk Promega, dalam aplikasinya ditambahkan buffer tambahan (misalnya buffer D, E, H) dan Acetylated BSA yang berfungsi untuk meningkatkan aktifitas atau untuk mengoptimalkan kerja enzim. 1 unit enzim restriksi didefinisikan sebagai jumlah atau banyaknya enzim yang dibutuhkan untuk memotong      1 µg DNA λ dalam 1 jam pada suhu 37⁰ C dalam 50 µl buffer uji mengandung Acetylated BSA yang ditambahkan sampai konsentrasi final sebanyak 0,1 mg/ml.

Buffer diberikan dalam tabung mikrosentrifuse berisi DNA plasmid, sebelum pemberian enzim restriksi. Hal ini dilakukan karena larutan DNA harus disesuaikan agar memberikan kondisi  yang tepat untuk aktifitas enzim yang maksimal. Kebanyakan endonuklease restriksi akan berfungsi baik pada pH 7,4 dan bervariasi dalam kekuatan ionik yang diperlukan (biasanya berasal dari NaCl dan Mg²⁺). Perlu diketahui bahwa semua endonuklease restriksi tipe II  membutuhkan Mg²⁺ untuk berfungsi. Senyawa pereduksi seperti Ditiotreitol juga perlu ditambahkan untuk menstabilkan enzim dan mencegah nonaktifitasnya. Maka komposisi buffer yang ditambahkan adalah sama yaitu: Tris-HCl dengan pH 7,5; NaCl; MgCl₂, dan Ditiotreitol (DDT).

Perbedaan satu buffer dengan buffer lainnya hanyalah pada konsentrasi tiap-tiap elemen tersebut, disesuaikan dengan karakter atau sifat dari masing- masing enzimnya.  Misalnya buffer E dengan 10x konsentrasi kerja, memiliki komposisi: 60mM Tris-HCl (pH 7,5); 1M NaCl; 60mM MgCl₂, dan 10mM DDT, sedangkan buffer H memiliki komposisi: 900mM Tris-HCl (pH 7,5); 500mM NaCl; 100mM MgCl₂, dan 10mM DDT. Penting kiranya membuat kondisi yang tepat untuk aktifitas enzim karena konsentrasi NaCl atau  Mg²⁺ yang tidak tepat dapat menyebabkan penurunan aktifitas, bahkan mengubah spesifikasi enzim sehingga pemotongan DNA terjadi pada sekuens pengenal tambahan yang tidak semestinya.

Dalam manual untuk tiap-tiap enzim akan disertakan pula informasi tambahan seperti persentase aktifitas buffer yang digunakan, suhu yang optimal untuk menginaktifasi kerja enzim, frekuensi pemotongan pada beberapa jenis plasmid dan DNA λ, persentase terjadinya pemotongan (Cut), ligasi (Ligation), dan pemotongan kembali (Recut) akan tertulis misalnya C/L/R: 100%:90%:90%. Pada praktiknya, enzim restriksi dapat memotong DNA dalam waktu minimal 2 jam, maksimal 4 jam inkubasi setelah pencampuran DNA dan enzim. Informasi tambahan dalam hal pemakaian buffer juga disertakan. Misalnya buffer B, C, dan D dapat digunakan dalam reaksi restriksi dengan enzim Pst I tetapi persentase keberhasilan pemotongan hanyalah 50-75%.  Apabila menggunakan buffer H maka tingkat keberhasilan adalah 100%, maka buffer H inilah yang kita pakai.

Suhu yang optimal untuk aktifitas enzim restriksi biasanya adalah 37⁰ C, tetapi beberapa yang lain memerlukan suhu optimal yang berbeda. Sebagai contoh, Taq I yang dimurnikan dari Thermus aquaticus yang hidup pada tempat dengan temperatur sangat tinggi,sumber air panas misalnya. Digesti restriksi dengan Taq I harus diinkubasi pada 65⁰ C untuk memperoleh aktifitas enzim yang maksimum.

Perlakuan untuk inakftifasi enzim berbeda-beda pula antara satu dengan yang lainnya. Inaktifasi enzim perlu dilakukan dalam proses kloning gen, karena bila tidak dinon-aktifkan, enzim akan mendigesti DNA lain yang mungkin ditambahkan pada tahap selanjutnya. Beberapa perlakuan yang dapat menon aktifkan enzim adalah pemanasan pada suhu 65- 70⁰ C dalam waktu yang pendek, atau penambahan EDTA yang akan mengikat ion Mg²⁺ sehingga mencegah kerja endonuklease restriksi.

Berdasarkan sifat-sifat utama yang dikode oleh plasmid, plasmid dapat

diklasifikasikan menjadi 5 jenis utama:

a. Plasmid fertilitas atau plasmid “F” yang hanya membawa gena tra dan tidak

mempunyai sifat lain kecuali kemampuan untuk melakukan transfer plasmid

dengan cara konjugasi.

b. Plasmid resistensi atau plasmid “R” membawa gena yang menyebabkan

resistensi bakteri tuan rumah terhadap satu atau lebih agen antibakteri, seperti

kloramfenikol, ampisilin dan merkuri.

c. Plasmid col mengkode kolisin, protein yang dapat membunuh bakteri lain.

d. Plasmid degradatif memungkinkan bakteri untuk mengadakan metabolisme

molekul yang tidak biasa, seperti toluen dan asam asetat.

e. Plasmid virulensi menyebabkan patogenitas pada bakteri tuan rumah (Brown,

2003).

Jumlah kopi menunjukkan jumlah molekul plasmid yang biasanya ditemukan dalam satu sel bakteri. Tiap-tiap plasmid mempunyai jumlah kopi antara 1-50 atau lebih (Brown, 2003). Berdasarkan jumlah kopi plasmid dapat diklasifikasikan menjadi dua yaitu: High Copy Number Plasmid dengan jumlah kopi lebih besar dari 20 kopi per sel bakteri dan Low Copy Number Plasmid dengan jumlah kopi lebih kecil dari 20 kopi per sel bakteri (Feinbaum, 1998). Kebanyakan plasmid yang berada dalam sel sebagai molekul yang sangat berlilit (supercoiled). Pelilitan (supercoiling) terjadi karena heliks ganda DNA plasmid sebagian terbuka oleh enzim yang disebut topoisomerase selama replikasi plasmid. Bentuk berlilit hanya dapat dipertahankan bila kedua untai polinukleotid

dalam keadaan utuh sehinggga disebut DNA sirkuler yang tertutup secara kovalen (covalently-closed-circular (ccc) DNA). Jika salah satu untai polinukleotid terputus maka heliks ganda akan kembali ke keadaan normalnya, yaitu berelaksasi, dan plasmid akan mengambil bentuk alternatif yang disebut sirkuler terbuka (open circular (oc)) (Brown, 2003).

Lebih jelasnya model konformasi DNA tersebut seperti tersaji pada Gambar

Gambar 2. Model Konformasi DNA

Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada Gambar 3. Plasmid pUC19 mempunyai berbagai sisi pemotongan untuk enzim BamHI. Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten terhadapampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam,sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19menjadi resisten terhadap ampisilin (Sambrook et al., 1989).

ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

TUJUAN :

Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII
2. Sampel DNA, misalnya :
   1. DNA kromosom bakteri,
   2. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)
   3. DNA plasmid hasil restriksi (cut)
3. Agarosa
4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)
5. Akuades
6. Gelas Ukur 1000 ml
7. Labu Erlenmeyer 50 ml
8. Tabung mikrosentrifuga
9. Sarung tangan
10. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
11. Kertas parafilm
12. seperangkat alat elektroforesis
13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM)
14. larutan Etidium Bromid (EtBr)
15. UV transluminator
16. Kaca mata UV
17. kamera digital

CARA KERJA

1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades.
2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.
3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)
4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki
5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 ⁰C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).
6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.
7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).
9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.
11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.
14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus.
15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.
16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator).
17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari “sumur” gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. “Marka” atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

Gel poliakrilamid vs gel agarose

1. Gel Poliakrilamid

• Lebih effektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5-500bp
• Power: ekstrim tinggi
• Ukuran perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp
  • Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarose, karena biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.
  • Medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan.

2. Gel Agarosa

• Power lebih rendah
• Mempunyai laju pemisahan lebih cepat
  • Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb tergantung dari konsentrasi gel agarose yang digunakan
  • Medan gerak biasanya horizontal

Electroforesis migration rate

Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarose dipengaruhi oleh beberapa factor utama, sebagai berikut:

1. Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional  log-10 dari jumlah pasangan basa.

2.Konsentrasi gel agarose

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: logm=logmo-Kr_T dimana mo adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan  _T adalah gel konsentrasi serta m adalah electrophoretic mobility DNA.

Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA

No	Konsentrasi Gel Agarose (%)	Effisiensi range Pemisahan pada DNA linier (kb)
1	0.3	60-5
2	0.6	20-1
3	0.7	10-0.8
4	0.9	7-0.5
5	1.2	6-0.4
6	1.5	4-0.2
7	2.0	3-0.1

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

• terutama konsentrasi gel agarose
• kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
• densitas kembaran superheliks pada bentuk I
• pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III
  • tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I
• konsentrasi EtBr kritis antara 0.1mg/ml-0.5ml/mg

4.Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarose bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature

Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30°C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar

6. Keberadaan pewarna DNA

Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.

7. Konposisi buffer elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarose. Missal:

• Tris-acetate; umu dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.
• Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose.

DNA plasmid yang dipotong dan akan digunakan sebagai vektor gen tertentu dari bakteri lain, harus diuji dulu keberhasilan pemotongannya oleh enzim restriksi. DNA hasil digesti restriksi divisualisasikan menggunakan teknik elektroforesis. Prinsip kerja elektroforesis adalah memisahkan molekul- molekul bermuatan listrik berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan muatan listriknya. Khusus untuk DNA pemisahan dilakukan berdasarkan ukuran dan konformasi molekulnya dengan menggunakan gel, biasanya agarosa, poliakrilamid, atau campuran keduanya.

DNA bermuatan listrik negatif sehingga akan berjalan menuju kutub positif (anoda) pada saat di running. Agarosa gel akan membentuk kerangka lubang-lubang yang kompleks untuk dilewati molekul DNA menuju elektroda positif. Makin kecil molekul DNA makin cepat migrasinya melewati gel, sebaliknya makin besar molekul makin lambat laju migrasinya melewati gel. Komposisi gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat dipisahkan. Lempeng 0,3% agarosa dengan tebal 0,5 cm yang mempunyai lubang relatif besar digunakan untuk molekul dengan ukuran 5-60 kb, sehingga memungkinkan misalnya, molekul 30 dan 35 kb dapat dibedakan dengan jelas. Molekul yang jauh lebih kecil (1 hingga 300 bp, RNA misalnya) digunakan gel poliakrilamid 40% yang sangat tipis (0,3 mm). Dengan gel poliakrilamid ini dapat dibedakan molekul- molekul dengan perbedaan panjang hanya 1 nukleotida. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan melihat atau membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standard (marker) yang telah diketahui ukurannya, misalnya menggunakan DNA λ.

Laju migrasi DNA pada gel juga dapat ditentukan oleh konformasi molekulnya. DNA dengan bentuk covalently closed circular (CCC) akan bergerak paling cepat disusul berikutnya konformasi open circular (OC), dan yang terakhir bentuk linier. Berdasarkan hal ini, maka penentuan ukuran suatu fragmen DNA dilakukan pada konformsi linier agar mudah dibedakan dari DNA yang belum terpotong.

Pada praktikum ini, gel agarosa yang dipakai adalah sebanyak 1% ditambah TAE 20 ml. Setelah dipanaskan hingga agarosa mencair dan ditunggu suhunya sekitar 60⁰ C, ditambahkan Etidium bromide sebanyak 1 μl. Etidium bromida akan menyisip diantara basa nukleotida sehingga pada saat dipaparkan sinar UV DNA akan berfluoresens sehingga dapat dilihat secara visual.

Sebelum sampel DNA di running pada gel agarosa, harus ditentukan lebih dahulu berapa jumlah DNA dan loading dye yang akan dimasukkan ke dalam sumuran. Loading dye berfungsi memudahkan masuknya DNA ke dalam sumuran gel. Dalam praktikum ini sample DNA yang dicampurkan adalah 5 μl sedangkan loading dye 6x sebanyak 1 μl sehingga didapatkan volume final sebanyak 6 μl yang dipipet ke dalam sumuran gel.

DNA yang kita migrasikan ada empat macam yaitu DNA lambda sebagai marker dipotong menggunakan HindIII, DNA kromosom bakteri yang tidak dipotong, DNA plasmid hasil isolasi yang belum dipotong, serta DNA plasmid yang dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI, Pst I, dan HindIII. Berikut ini adalah gambar hasil elektroforesis gel agarosa dari sampel DNA tersebut di atas.

Keterangan:

1 = Marka (λ/hind III)

2 = K1 (pUC + HindIII)

3 = K2 (pUC + E. Cory I)

4 = K3 (pUC + Pst  I)

5 = K4 (pUC + E. Cory I)

6 = A1 (pUC + E Cory I)

7 = A2  (pUC + Pst I)

8 = A3 (pUC + HindIII)

9 = A4 (pUC)

10 = K1 (pUC hasil isolasi)

11 = K2 (pUC hasil isolasi)

Gambar 2. Hasil dari elektroforesis selama 45 menit dengan tegangan 90 volt dilihat dengan sinar UV. Disampingnya adalah gambar DNA marker.

PERHITUNGAN

Untuk menghitung panjang pita DNA menggunakan program excel. Setelah mengukur panjang pita yang terlihat dari hasil transluminator UV dengan cara mengukur panjang dari sumuran dengan menggunakan penggaris, data yang diperoleh diolah dengan program excel. Dari proses perhitungan ini diperoleh persamaan regresi logaritmik yang digunakan untuk DNA marker data yang diperoleh adalah :

DNA Lambda marka (bp)	Jarak migrasi DNA Lambda marka(mm) (pada sumuran 1)
23130	14
9146	23
6557	27
4361	37

Grafik yang diperoleh dari data tersebut adalah:

Persamaan garis yang diperoleh dari grafik tersebut adalah y = -0.031x + 4.738
R² = 0.941. Dengan menggunakan persamaan ini dapat ditentukan ukuran DNA sampel berdasarkan jarak migrasinya adalah :

Sumuran	Jarak migrasi DNA sampel (mm)	Ukuran DNA sampel (bp)
2	34	4830
3	33	5188
4	32	5571
5	33	5188
6	39	3380
7	32	5571
8	33	5188
9	41	2930
10	42	2728
11	43	2540

Hasil praktikum menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak migrasi DNA marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada sumuran ke 10 pita DNA tidak jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat. Hal ini dimungkinkan saat meletakkan DNA pUc hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran sehingga hasil elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas atau mungkin karena kesalahan teknis lain. Selain itu yang menyebabkan kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat karena adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui jarak migrasi pastinya. Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Hampir semua sumuran menunjukkan adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear dan kurang jelas yang merupakan ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya smear. Bentuk DNA (plasmid) yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk supercoiled. Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi, relaxed circular, linear, dan nicked open circular. Hal yang dapat menyebabkan tertumpuknya sumuran ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses elektroforesis yang dilakukan. DNA plasmid yang digunakan untuk proses elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid dalam bakeri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada proses penetralan jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu kuat maka DNA kromosomal dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid yang digunakan untuk tahap selanjutnya. Dalam proses elektroforesis itu sendiri banyak hal yang mempengaruhi migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis.

ACARA V. TRANSFORMASI

TUJUAN : Melakukan transformasi DNA ke dalam sel inang bakteri E.coli.

BAHAN ADAN ALAT

1. strain E. coli JM 109
2. media LB cair
3. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin
4. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG
5. es batu
6. shaker-incubator
7. termometer
8. Tabung mikrosentrifuga
9. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
10. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)
11. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)
12. jarum ose
13. batang drugalsky
14. cawan Petri
15. Erlenmeyer
16. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)
17. kamera digital.

CARA KERJA

1. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37^oC selama 16 jam (semalam).
2. Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37^oC.
3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es.  Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam.
6. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.
7. Kedua  tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42^oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.
8. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37^oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.
9. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung.  Selain itu, sebanyak  50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin.  Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37^oC.
10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19  rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5).
11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42^oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.
12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37^oC.
13. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37^oC selama lebih kurang 30 menit.
14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl.
15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.  Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.
16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37^oC.
17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.
18. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut: Dimana, Σkolon

i         =  jumlah koloni putih (dalam cfu)

[pUC19] =  konsentrasi pUC19 (dalam ng)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.

Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.

Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.

Hasil kegiatan transformasi kelompok kami (kelompok 3)yang dilakukan pada praktikum ini dapat dilihat pada tabel dan photo berikut :

Tube	I (mengandung Plasmid pUC)	II (tidak mengandung plasmid pUC)
Media
LB Ampisilin	Ada/tumbuh (tidak rata)tertransformasi 156 koloni	Ada/tumbuh Tertransformasi 11 koloni
LB	Ada/tumbuh rata	Tumbuh rata

Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman. Amphisilin dalam medium akan memastikan bahwa hanya bakteri yang mengandung plamid (pUC) yang dapat tumbuh, karena adanya resistensi amp_R.

Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.

Hasil pengamatan menunjukkan pada pUC yang ditambah LB amphisilin (LB-Amp), setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 156 koloni, sedangkan pada pUC LB Non-Amp koloni terlalu banyak (TBUD) atau rata. Pada Non-pUC LB non-Amp hasilnya juga terdapat banyak koloni  (TBUD). Hasil transformasi yang tidak benar terjadi pada hasil Non-pUC LB-Amp yang seharusnya kosong tapi disini pada kelompok 3 ada 11 koloni yang tumbuh, seharusnya tidak tumbuh. Hal ini dimungkinkan amphisilin telah rusak, karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media seleksi.

Daftar Pustaka

Fuji Lestari, (2008), Uji Aktivitas Pemotongan DNA Superkoil Fraksi Protein Daun Kucing-Kucingan (Acalipha indica L) Terhadap pUC 19, Skipsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhamadiyah Surakarta, Surakarta.

http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/isolasi-plasmid-metode-lisis-alkali.html

Maniatis T et al, 1982-Molecular cloning : A Laboratory Manual. CSH.

http://joelnaga.blogspot.com/2009/12/pembuatan-sel-kompeten-dan-transformasi.html

Assalamualaikum, wr.wb

Pa, tugas saya sudah saya unggah, dan dapat dilihat di halaman tugas kuliah biologi sel molekuler. Semoga dapat memenuhi harapan Bapak.  Juga untuk rekan-rekan mohon dikomentari ya…terima kasih.

Mata kuliah Biologi Mikroba tropis hari rabu pagi dipindah ke selasa siang jam 14.00 setelah kuliahnya Biologi Sel Molekuler ini jadwal seterusnya lho coz Prof. Agus nya tidak bisa rabu pagi harap diperhatikan oleh rekan-rekan satu kelas mikro.

Kuliah ga jadi batal semua

Welcome to your brand new blog at Edublogs.

To get started, simply log in, edit or delete this post and check out all the other options available to you.

Also, please consider becoming an Edublogs Supporter – you can remove ads from yours and other blogs, upload up to 5GB or audio, video and every other sort of content and access great features under your ‘Plugins’ menu.

Supporters are what keeps Edublogs running and providing free blogs for education, so give it a go today

For assistance, visit our comprehensive support site, check out our getting started with Edublogs guide or stop by The Edublogs Forums to chat with other edubloggers.

You can also subscribe to our brilliant free publication, The Edublogger, which is jammed with helpful tips, ideas and more.

And finally, if you like Edublogs but want to be able to simply create, administer, control and manage hundreds of student and teacher blogs at your school or college, check out Edublogs Campus… it’s like Edublogs in a box, all for you.

Thanks again for signing up with Edublogs!